Lesitinaasitesti-Objectives, Principle, Procedure and Results

biologia Educational Videos

Last Updated on February 4, 2021 by Sagar Aryal

Objective of Lesitinase Test

tavoitteena on selvittää mikro-organismien kyky tuottaa lesitinaasientsyymiä ja tunnistaa bakteerit, jotka kykenevät tuottamaan lesitinaasientsyymiä.

Lesitinaasitestin periaate

Lesitinaasit tai fosfolipaasit ovat bakteerien vapauttamia entsyymejä, joilla on kyky tuhota eläinten kudoksia ja joilla on rooli patogeenisyydessä. Lesitinaasi, jota kutsutaan myös fosfolipaasi C: ksi, on tällainen entsyymi, joka jakaa fosfolipidilesitiinin. Fosfolipidikompleksit ovat yleensä emulgointiaineita, joita esiintyy kudoksissa, seerumissa ja munankeltuaisessa. Lesitiini on normaali osa munankeltuaista. Lesitinaasiaktiivisuutta käytetään kuvaamaan useita grampositiivisia ja gramnegatiivisia bakteereja. Bakteerilesitinaasit hajottavat tämän lesitiinin liukenemattomaksi diglyserideiksi, mikä johtaa läpinäkymättömään sädekehään, joka ympäröi pesäkettä, kun sitä kasvatetaan munankeltuaisen agar-alustalla.

Munankeltuaisagar on differentiaali-ja rikastusaine, jota käytetään eri lajien eristämiseen ja oletettuun erotteluun niiden lesitinaasi-ja lipaasituotannon sekä proteolyyttisen aktiivisuuden perusteella. Munankeltuaisagarissa lipoproteiinikomponentti Lesitovitelliini voidaan myös jakaa lesitinaasin avulla fosforyylikoliiniksi ja liukenemattomaksi diglyseridiksi, jolloin väliaineeseen muodostuu sakka. Tämä sakka esiintyy valkoisena sädekehänä, joka ympäröi lesitinaasientsyymiä tuottavaa pesäkettä. Syntynyt opalesenssi johtuu vapaan rasvan vapautumisesta.

Huomautus:

Bacillus cereus, aerobisten itiöiden tuottaja on vahva lesitinaasipositiivinen organismi, voidaan tunnistaa mannitoli-munankeltuainen-polymyksiini (MYP) – agar-levyistä. B. cereus on tyypillisesti mannitolinegatiivinen, tuottaa pink-punaisia pesäkkeitä MYP-agarissa, jossa pesäkkeiden ympärillä on saostumisvyöhyke, mikä osoittaa lesitinaasipositiivista aktiivisuutta. Clostridium perfringens-bakteerin tunnistamiseen ja sen erottamiseen muista Clostridia-lajeista käytetään Munankeltuaisagaria. Se on rikastettu, epäselektiivinen ja differentiaalinen väliaine, ja sitä käytetään myös Nagler-testissä Clostridium perfringens-bakteerin oletettuun tunnistamiseen. Se on pakattu hapettomaan, pelkistettyyn tilaan, jotta estetään myrkyllisten hapettuneiden sivutuotteiden muodostuminen, jotka vahingoittavat velvoitettuja anaerobeja ja estävät tarkempien lajien kasvua. Positiiviselle lesitinaasitestille on ominaista valkoisen, läpinäkymättömän, diffuusin vyöhykkeen ulkonäkö, joka ulottuu pesäkkeitä ympäröivään väliaineeseen.

Lesitinaasitestissä käytetty väliaine

munankeltuainen agar medium

kaseiinin haimasyöpä 15, 0 gm
K-vitamiini 1 10, 0 gm
natriumkloridi 5, 0 gm
soijajauhon Papaic Digest 5,0 gm
hiivauute 5.0gm
L-kystiini 0, 4 gm
Hemin 5, 0 mg
munankeltuainen Emulsio 100, 0 ml
Agar 20, 0 gm

lopullinen pH 7.0 +/- 0.3 25ºC: ssa.

Lesitinaasitestin menettely

  1. otetaan silmukka testiorganismia ja viirutetaan se suoraksi viivaksi lautaselle.
  2. inkuboidaan anaerobisesti gas pak-purkissa heti viirutuksen jälkeen ja siirretään inkubaattoriin, jota pidetään 35-37o C: ssa 24-48 tunnin ajan anaerobeilla ja aerobeilla levy inkuboidaan 35-37o C: ssa 24-48 tunnin ajan.
  3. tutkitaan levystä inokulumeja ympäröivä opaalinhohtoinen sädekehä.

Lesitinaasitestin tuloksen tulkinta

Lesitinaasitestin

positiivinen lesitinaasitesti: valkoinen, läpinäkymätön, diffuusi vyöhyke, joka ulottuu pesäkkeitä ympäröivään väliaineeseen.

negatiivinen lesitinaasitesti: ei valkoista, läpinäkymätöntä vyöhykettä, joka ulottuu pesäkkeen reunasta.

Lesitinaasitestin rajoitukset

  • anaerobisen tilan ylläpito on pakollista.
  • negatiivista lesitinaasitestiä on verrattava inokuloimattomaan kontrollilevyyn, koska lesitinaasi voi diffusoitua koko agar-levylle ja vaikeuttaa tulkintaa.
  • perfringenstyypin a-antitoksiini ei ole spesifinen C. perfringensille ; positiivisen Nagler-reaktion voivat tuottaa myös C. bifermentans , C. sordelli ja C. baratti if heavy inoculum are used.

Quality Control of Lecithinase Test

Clostridium perfringens, ATCC13124: lecithinase positive

Clostridium sporogenes, ATCC11437: lecithinase negative

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.